Rabu, 04 Januari 2012

Laporan Praktikum Mikrobiologi : Pewarnaan Gram dan Spora

Laporan Praktikum                                        Hari                  : Sabtu
Mkrobiologi                                                   Tanggal             : 8 Oktober 2011
                                                                       Waktu               : 11.00-12.40
                                                                       PJP                    : Rina Martina, M.Si               Asisten                       : Harry Noviardi,M.Si
  M. Arif Mulya, S.Pi



PEWARNAAN GRAM DAN PEWARNAAN SPORA



Kelompok 3
                        Arfiyah Tri Meirina                             J3L110030








ANALISIS KIMIA
DIREKTORAT PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Pendahuluan
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan  fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana 2008).
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Karmana 2008).
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan  kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Karmana 2008).
Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetative ataupun mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan hijau malasit. Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetative (James 2002).

Tujuan
Praktikum bertujuan mewarnai dan mengidentifikasi bakteri dan spora di bawah mikroskop.

Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah kawat ose, tabung eppendorf, spirtus, kaca preparat, dan mikroskop electron.
Bahan-bahan yang digunakan ialah aquades, alcohol 70%, kristal violet atau kristal ungu, Kalium Iodida (KI), Alkohol 96%, safranin, minyak imersi, dan malasit green.

Prosedur
Pewarnaan Gram
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum. Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja  steril serta kering. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Biakan bakteri diambil dari tabung eppendorf menggunakan kawat ose yang telah disterilkan sebelumnya, dengan cara kawat ose dibakar di atas spirtus hingga memijar, kemudian didinginkan dan setelah dingin dimasukkan ke dalam tabung eppendorf untuk pengambilan bakteri. Bakteri yang diambil harus ditotolkan pada kaca preparat dalam jumlah yang cukup banyak. Kemudian fiksasi udara dilakukan atau dikeringkan dengan udara. Setelah biakan cairan kering, kristal violet atau ungu kristal diteteskan diatas biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri. Kristal ungu dibiarkan melekat hingga satu menit sambil digoyan-goyangkan. Lalu dibilas dengan aquades dari bagian samping kaca preparat hingga mengalir dan jangan langsung terkena biakan bakterinya. Kaca preparat dikering udarakan kembali, lalu diteteskan KI (Kalium Iodida) hingga menutupi seluruh area biakan bakteri dan dibiarkan selama satu menit. Lalu dibilas kembali dengan aquades dan dikering udarakan. Biakan bakteri diteteskan kembali dengan alcohol 96% secara merata selama 30 detik. Lalu biakan bakteri dibilas atau dicuci lagi dengan aquades dan dikering udarakan. Safrani dieteskan pada biakan bakteri secara merata dan didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, dibilas dengan aquades dan dikering udarakan. Kemudian kaca preparat berisi bakteri tersebut diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan memakai minyak imersi.
Pewarnaan Spora
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum. Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja  steril serta kering. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Pewarnaan spora dilakukan dengan cara biakan bakteri diambil dengan kawat ose yang telah disterilkan terlebih dahulu dengan cara menotolkannya di atas kaca preparat dalam jumlah yang cukup banyak. Kemudian fiksasi udara atau dikering udarakan. Malasit green diteteskan pada biakan bakteri hingga menutupi area bakteri. Lalu difiksasi panas atau dipanaska di atas Bunsen namun jangan terlalu dekat dengan api. Setelah itu safranin diteteskan dan didiamkan selama 30 detik. Kemudian dibilas dengan aquades dan dikering udarakan, serta diamati di bawah mikroskop.

Data dan Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Pewarnaan Gram
Sample (Tabung)
Gram
Morfologi Sel
Penataan Sel
1
-
Basil
Streptococcus
2
-
Basil
Streptococcus
3
-
Basil
Streptococcus
4
+
Basil
Diplobasil
5
-
Basil
Streptococcus
Keterangan :    +    = bakteri berwarna ungu
-          = bakteri berwarna merah











Gambar 1. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 1
Gambar 2. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 2
Gambar 3. Hasil Pewarnaa Gram pada Sample Tabung 3
Gambar 4. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 4
Gambar 5. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 5

Tabel 2. Hasil Pewarnaan Spora
Sample (Tabung)
Gram
Morfologi Sel
Penataan Sel
1
+
Basil
Streptococcus
2
+
Basil
Streptococcus
3
+
Basil
Streptococcus
4
+
Basil
Diplobasil
5
+
Basil
Streptococcus
Keterangan :    +    =   membentuk spora dan berwarna hijau

Gambar 6. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 1
Gambar 7. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 2
Gambar 8. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 3
Gambar 9. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 4
Gambar 10. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 5

Pembahasan
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium spp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau ( James 2002).
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Sample biakan bakteri berbentuk suspense homogen agar bakteri dapat menyebar dan tidak menumpuk pada kaca preparat. Kemudian dikering udarakan atau fiksasi udara agar bakteri menempel pada kaca preparat. Fiksasi panas atau dikeringkan dengan pemanasan biasanya di atas spirtus pada pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri diteteskan Kristal ungu yang berfungsi memberikan pewarnaan pada bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penetesan Kristal ungu harus merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat terwarnai denga sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dikering udarakan selama satu menit sambil digoyangkan. Lalu dibilas dengan aquades dengam cara mengalirkannya, bukan dengan penyemprotan secara langsung pada bakteri tersebut karena dapat menyebabkan bakteri rusak terkena semprotan aquades. Bakteri dikering udarakan kembali. Setelah itu, ditambahkan KI (Kalium Iodida) agar dapat menyatu dengan ungu Kristal yang membentuk kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu. Kemudian dikering udarakan dan dibilas dengan aquades. Alkohol 96% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu dan KI (UK-Y) pada gram negative, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga kompleks UK-Y tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu. Sedangkan pada gram negative lipid tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan dinding sel. Setelah dibilas, penambahan safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk mewarnai gram negative yang semula telah luntur pewarnaannya menjadi warna merah. Hasil akhinya adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu dan bakteri gram negative akan berwarna merah. Pengamatan gram dapat dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan harus menggunakan minyak imersi.
Data dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa tabung eppendorf berisi sample 1, 2, 3, dan 5 mengandung bakteri gram negative dengan morfologi sel basil (batang) dan penataan sel streptococcus yaitu bentuk rantai bulat. Sedangkan pada tabung 4 menghasilkan gram positif, morfologi sel batang atau basil, dan penataan sel diplobasil yaitu berbentuk dua batang berjejer. Seharusnya semua hasil pada berbagai tabung adalah gram negative karena berasal dari suatu sampe yang sama maupun berbeda media. Penyimpangan hasil pada tabung 4 dapat disebabkan oleh berbagai faktor, misalnya pada saat melakukan fiksasi, fiksasi yang dilakukan adalah fiksasi pemanasan dengan dipanaskan di atas spirtus, bukan dengan fiksasi udara sehingga setelah dilakukan pewarnaan dengan ungu Kristal, bakteri yang telah dipanaskan warna ungunya akan sangat melekat dengan gelas objek atau kaca preparat dan akan sangat menyerap ke dalam dinding sel. Saat pewarnaan selanjutnya dan dengan safranin yang sejharusnya mencirikan gram negative berwarna merah, tidak dapat mengisi warna merah pada dinding sel akibat alcohol yang juga tidak bisa meluruhkan dinding sel (warna ungu) dikarenakan warna ungu sudah terlalu melekat pada dinding sel akibat fiksasi pemanasan.
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora juga disebut endospora yang masih terletak didalam sel bakteri. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetative, Sporulasi (proses pembentukan spora) dapat dicegah apabila selalu diadakan pemindahan biakan ke medium yang baru (Sudjadi 2006).
Pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit, bakteri penghasil endospora akan menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan hijau malasit tidak dapat diikat (Pearce 2009).
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi pemanasan agar bakteri dapat sangat melekat pada kaca preparat dan membuat bakteri merasa terancam sehingga membuat spora. Kemudian preparat diteteskan malasit hijau secara merata yang berfungsi sebagai pewarnaan primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas spirtus yang bertujuan untuk membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan aquades dengan cara mengalir dan dikering udarakan bertujuan untuk menghilangkan malasit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaan dengan safranin bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora. Kemudian dibilas kembali denan aquades atau air mengalir agar warna safranin luntur dan dikerigkan agar warna cepat kering dan terlihat. Kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan memakai minyak imersi.
Data dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa semua bakteri dari seluruh tabung dapat menghasilkan spora yang ditandai dengan terbentuknya warna hijau akibat pewarnaan malasit green, dengan morfologi sel basil, penataan sel streptococcus. Sedangkan tabung 4 hanya berbeda penataan sel yaitu diplobasil mengikuti bentuk penataan sel bakteriya namun tetap berwarna hijau. Spora yang terbentuk oleh bakteri  mengindikasikan bahwa bakteri telah terancam atau dalam keadaan berbahaya akibat lingkungan yang tidak mendukung untuk mempertahanka keturunannya, sehingga spora kan terbang dan mencari media baru serta berkembang biak.
Jamur dan fungi tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan gram dan biasanya diidentifikasi dengan pewarnaan jaringan yang terinfeksi untuk melihat struktur tipikal. Kultur murni dapat diwarnai dengan metilen biru atau malasit hijau untuk menunjukkan struktur reproduksinya (Firmansyah 2009).

Simpulan
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa bakteri dari hasil pewarnaan gram ialah gram negative yang berwarna merah, sedangkan pada pewarnaan spora, bakteri dapat menghasilkan spora yang berwarna hijau.

Daftar Pustaka
Firmansyah Ricky. 2009. Mudah dan Aktif Belajar Biologi. Jakarta :  Grafindo Media Pratama (halaman : 109)
James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Retno Indah, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Principles of Science for Nurses (halaman : 115)
Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama (halaman : 56)
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari : Anatomy and Physiology for Nurses (halaman : 200)
Sudjadi Bagod. 2006. Biologi Sains Dalam Kehidupan. Jakarta : Yudhistira Ghalia Indonesia (Halaman : 16)






Tidak ada komentar:

Poskan Komentar