Rabu, 04 Januari 2012

Laporan Praktikum Mikrobiologi : Ekstraksi DNA, Teknik PCR, dan Elektroforesis

Pendahuluan
Kemiri sunan merupakan salah satu tanaman penghasil biodiesel dengan potensi yang sangat besar disamping pemanfaatannya sebagai tanaman konservasi. Minyak kemiri sunan mengandung racun sehingga tidak dapat dikonsumsi. Dikatakan bahwa asam α-eleostearat dengan kandungan 50% dalam minyak merupakan senyawa yang mengakibatkan minyak kemiri sunan beracun. Sebagai tanaman yang potensial, maka sangat diperlukan informasi lengkap tentang tanaman tersebut, termasuk analisis DNA. Berbagai teknik dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman, organ tanaman, atau jaringan tanaman yang digunakan (Alves 2001).
DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (JOSE dan USHA, 2000). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (SURZYCKI, 2000).
Ekstraksi DNA memiliki prinsip memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Alves 2001).
Polymerase Chain Reaction ( PCR) adalah proses penggandaan DNA secara in vitro dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target. Reaksi PCR dibantu oleh enzim polimerase dan oligonukleotida yang berperan sebagai primer dan terjadi dalam thermocycler. Primer terbagi dua yaitu primer forward ( primer yang berada sebelum target ) dan primer reverse (primer yang berada setelah target).  Antar primer terdapat puluhan hingga ribuan nukleotida yang menandakan panjang target DNA. Selain enzim polimerase, dibutuhkan dNTPs yang terbagi dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (nukleotida berbasis Sitosin) dan dTTP (nukleotida berbasis Timin) (Muladno 2002).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro 1998).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro 1998).

Tujuan
Praktikum bertujuan untuk mendapatkan teknik isolasi DNA berkualitas tinggi dari daun kemiri sunan dengan menggunakan kombinasi antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, namun tanpa penggunaan nitrogen cair sewaktu penggerusan ataupun penyimpanan lebih lama (over night) terhadap ekstrak daun yang telah digerus sebelum dilakukan purifikasi seperti yang sering dilakukan untuk tanaman tahunan, sehingga dapat menghemat biaya dan waktu. Serta untuk mengetahui sistematika ekstraksi DNA, teknik PCR dan elektroforeis DNA.

Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah timbangan analitik, mesin PCR, perangkat elektroforesis, gel documentation, waterbath, sentrifus, microwave oven, lemari es dan freezer, vortex mixer, alat gelas, mortar dan pestel, spatula, gunting, pipet ukur, pipet mikro, tip mikro, pH meter, tabung mikrosentrifus, dan sarung tangan karet.
Bahan-bahan yang digunakan adalah contoh daun muda tanaman kemiri sunan yang diambil dari kebun koleksi plasma nutfah dan kebun Agro Widya Wisata, Pakuwon, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri (BALITTRI), Sukabumi, dan paket bahan kimia  yang digunakan dalam kegiatan isolasi DNA pada umumnya seperti media PCR, Media agarose 1% (media agar), 70% etanol, buffer steril atau air keran, buffer ekstrasi (2% CTAB, 100 mM Tris-HCL pH 8.0, 1.4 NaCl, 20 mM EDTA), chloroform-isoamyl alkohol, 7.5 M ammonium asetat, dan absolut ethanol dingin.

Prosedur
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Protokol yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah prosedur ekstraksi yang dikembangkan oleh DOYLE dan DOYLE (1987) berbasis CTAB dengan modifikasi penambahan 2% Polivinilpolipirolidon (PVPP). Sampel daun muda segar (Gambar 1) dari Kemiri Sunan ditimbang sebanyak 0,5 - 0,7 g, lalu diletakkan dalam cawan porselein steril dan ditambahkan 400 ul buffer ekstraksi CTAB kemudian digerus dengan mortar steril sampai daun lumat. Daun sampel yang telah lumat dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml, kemudian ditambahkan kembali buffer ekstraksi CTAB sebanyak 400 μl dan divortex selama 2-3 menit.
Tahapan selanjutnya dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 65°C selama 15 menit sambil tabung dibolak-balik setiap 5 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian divortex selama 2- 3 menit, selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 25°C. Tujuannya untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi penyebab kontaminasi dengan DNA.
Supernatan yang telah diperoleh kemudian diambil dan ditambahkan dengan larutan Chloroform: Isolamylalkohol atau Chisam dengan perbandingan 24:1. Penambahan chisam ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Chloroform merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid, dan molekul lain seperti polisakarida, sehingga diharapkan akan diperoleh supernatant berisi DNA yang bebas kontaminan. Suspensi kemudian divortex sampai rata untuk optimalisasi homogenasi.
Selanjutnya suspensi disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 25°C selama 10 menit, sehingga diperoleh suspensi dengan tiga lapisan; lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh, dan lapisan bawah berupa pelet yang berwarna hijau tua. Supernatan pada lapisan paling atas diambil dan ditambahkan dengan 2/3 x volume larutan isopropanol dingin untuk presipitasi DNA. Supernatan yang telah ditambahkan isopropanol kemudian digoyang perlahan-lahan dengan cara membolak-balikkan tabung. Untuk mengendapkan DNA (pelet DNA), larutan disentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C selama 20 menit.
Endapan DNA dicuci dua kali dengan 70% etanol sebanyak 500 ul, disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4°C, kemudian cairan etanol dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan, lalu dilarutkan dalam 50 μL bufer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) dan ditambahkan 1 μL RNAse A (10 mg/ mL) kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit sampai 1 jam. DNA disimpan dalam refrigerator sampai siap digunakan.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan kualitas untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0 (SAMBROOK et al., 1989). DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalam analisis PCR. Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk  mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi.
Amplifikasi DNA
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Mesin PCR (MJ Research tipe PCT-100), dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94°C, dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit pada suhu 94°C (denaturasi), 1 menit pada suhu 37°C (annealing), 2 menit pada suhu 72°C (ekstensi). Seluruh produk amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit pada suhu 72°C. Analisis PCR dilakukan dengan total reaksi 20 l mengandung 10 ng DNA genomik cetakan, masing-masing dNTP 0,1 M (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), masing-masing primer RAPD 0,25 pmol, enzim Taq DNA polymerase 0,04 unit dalam larutan buffer 1X (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol, 0,5%, Tween 20, 0,5% nonidet P40 dan MgCl2 1,5mM). Hasil amplifikasi divisualisasikan menggunakan elektroforesis horizontal dengan gel agarose 1,5% (w/v) dalam buffer 1x TAE. Gel agarose kemudian direndam di larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD Gel Doc™ EQ.

Data dan hasil Pengamatan
Gambar 1. Daun muda yang digunakan untuk sampel
Gambar 2. Hasil pengecekan kualitas DNA sampel kemiri sunan dengan gel elektroforesis 1%
Gambar 3. Contoh pola pita hasil amplifikasi PCR menggunakan cetakan DNA kemiri sunan hasil ekstraksi dengan teknik miniprep CTAB
Gambar 4. alat elektroforesis saat sebelum dipisahkan
Gambar 5. alat elektroforesis saat setelah dipisahkan
Gambar 6. Sisir untuk membuat kolom elektroforesis gel



Tabel 1. Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas DNA kemiri sunan menggunakan spektrofotometer
Sample
Konsentrasi (ng/μl)
Kemurnian (A260/A280)
1
3.863,31
1,80
2
4.546,55
1,81
3
2.823,42
1,86
4
2.562,01
1,79
5
5.031,39
1,80
6
668,80
1,92

Pembahasan
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Susanti 2003).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Suharsono 2006).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom (Susanti 2003).
Prinsip kerja dari ekstraksi DNA / DNA Extraction yaitu :
Preparasi sel/jaringan 
Darah yang digunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi untuk mendapat hasil optimal,leukosit disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 – 5 ml whole blood.
Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.
Lisis membran sel/organella (nukleus)
Senyawa yang digunakan untuk melisiskan membran yaitu Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti phenol.
Denaturasi senyawa organik 
Untuk medenaturisasi protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi .
Presipitasi DNA
Digunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolute dan sodium asetat 1:10.
Pencucian/washing
Pencucian sisa senyawa mengunakan Ethanol 70% (Bartfai 2003).

Metode-metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA yaitu :
Phenol:chloroform 
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.
Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein.
Guanidine isothiocyanate 
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.
Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005).
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri 2004).
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Campbell 2002).
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase(Giri 2004).
PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Secara ringkas, prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 94-95oC, DNA mengalami denaturasi (pembelahan untai ganda menjadi untai tunggal). Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95oC atau 15 detik pada suhu 97oC. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi enzim taq polymerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai sering kali dilakukan pre denaturasi selama 3-5 menit, untuk menyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi (Giri 2004).
Tahapan PCR yaitu :
Denaturasi 
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC – 95oC. 
Penempelan primer 
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC. 
Reaksi polimerisasi (extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polymerase (Campbell 2002).
Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler (Brodgen 2000).
Agarose gel elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan besar molekul. Pemisahan molekul terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang negatively charged yang menembus matriks agarose dalam tank elektroforesis. Molekul dengan berat molekul lebih rendah akan bergerak lebih cepat. Setelah pembuatan gel elektroforesis, DNA dapat segera dirunning tetapi sebelumnya perlu diberi loading buffer (Bromophenol blue) untuk memberikan berat sampel dan sebagai penanda sampai kapan elektroforesis bisa dihentikan (Susanti 2003).
Faktor yang paling penting pada proses elektroforesis adalah panjang molekul DNA, molekul yang lebih kecil akan lebih mudah berjalan atau dapat lebih jauh. Tetapikonformasi molekul DNA juga merupakan suatu faktor. Untuk menghindari masalah ini molekul linear DNA biasanya dipisahkan, dengan supernatant dan PCR. Untuk Meningkatkan konsentrasi agarosa gel migrasi mengurangi kecepatan dan memungkinkan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil. Semakin tinggi tegangan, DNA semakin cepat bergerak. Tetapi tegangan dibatasi oleh kenyataan bahwa ia memanaskan dan akhirnya menyebabkan gel mencair (Susanti 2003).
Pewarna yang paling umum digunakan untuk membuat DNA atau RNA dapat terlihat pada saat elektroforesis gel agarosa adalah ethidium bromida (EtBr). Yang dapat menyala di bawah sinar UV. Setiap band yang mengandung lebih dari ~ 20 ng DNA menjadi jelas terlihat. Namun EtBr diketahui sebagai mutagen. Bahkan pencahayaan yang singkat asam nukleat sinar UV menyebabkan kerusakan yang signifikan pada sampel. UV merusak sampel dengan mengurangi efisiensi manipulasi berikutnya, seperti ligasi dan kloning. Jika DNA itu akan digunakan setelah perpisahan pada gel agarosa, yang terbaik adalah untuk menghindari paparan sinar UV dengan menggunakan sumber eksitasi cahaya biru seperti Xcitablue UV terhadap cahaya biru layar konversi dari Bio-Rad atau Dark Reader dari Clare Chemicals (Muladno 2002).
EtBr sebagai pewarna DNA tidak terlihat dalam cahaya alami, ilmuwan mencampur bermuatan negatif DNA dengan loading dye (bufer) sebelum menambahkan campuran ke dalam gel. Loading buffer berguna karena mereka terlihat dalam cahaya alami (sebagai lawan dari sinar UV untuk bernoda EtBr DNA), dan mereka bersama-sedimen dengan DNA (berarti mereka bergerak dengan kecepatan yang sama seperti DNA panjang tertentu). bufer yang digunakan untuk elektroforesis agarosa. Yang paling umum adalah: Tris Asetat  EDTA(TAE), Tris borat EDTA (TBE) dan lithium borat (LB). TAE memiliki kapasitas bufering terendah tetapi memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar. Ini berarti tegangan yang lebih rendah dan lebih banyak waktu, tetapi produk yang lebih baik. LB relatif baru dan tidak efektif dalam memecahkan fragmen-fragmen yang lebih besar dari 5 kbp; Namun, dengan konduktivitas rendah, serta mampu digunakan pada tegangan yang lebih tinggi (sampai 35 V/ cm), yang berarti analisis yang lebih singkat waktu untuk rutin elektroforesis (Muladno 2002).
Tanaman kemiri sunan merupakan tanaman tahunan yang mengandung senyawa metabolit sekunder yang cukup tinggi, seperti getah dan polifenol, sehingga perlu dilakukan optimasi dalam mengisolasi DNAnya untuk memperoleh DNA dengan kualitas yang tinggi. DNA tanaman dengan kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasi fragmen DNA tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi pada metode ekstraksi yang sudah baku pada tanaman tertentu perlu dilakukan (Syafaruddin 2010).
Teknik ekstraksi kemiri sunan digunakan fenolkloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Apabila fenol-kloroform masih berada di dalam sampel maka ada kemungkinan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler (Syafaruddin 2010).
Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh dari sampel-sampel kemiri sunan memiliki kualitas dan kuantitas DNA yang cukup baik (Tabel 1). Kuantitas DNA yang diperoleh mempunyai kisaran antara 668,80 - 5.031,39 ng/ul. Jumlah DNA ini relatif cukup banyak danCdapat digunakan untuk analisis PCR sampai ratusan kali. Sementara itu, kualitas DNA yang diperoleh juga berada pada kisaran angka dimana DNA dikatakan murni yaitu antara 1,8-1,9. Seperti dijelaskan dalam SAMBROOK et al. (1989) bahwa DNA dikatakan murni apabila mempunyai angka A260/A280 dalam kisaran 1,8-2,0. Hasil pengecekan kualitas DNA dengan menggunakan gel elektroforesis 1% juga menunjukkan hasil yang cukup memuaskan dimana DNA yang diperoleh terlihat utuh (Gambar 2). DNA yang utuh ditandai dengan tidak adanya smear DNA yang dielektroforesis. Hal ini menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat. Penggerusan secara langsung sampel segar tanpa penyimpanan selama semalam dan tanpa penggunaan nitrogen cair (yang diketahui sangat membantu untuk menghancurkan jaringan dan melindungi DNA dari degradasi oleh enzim DNase) tetapi hasil yang diperoleh sangat memuaskan yang ditandai dengan kualitas DNA yang utuh dan murni dilihat dari nilai rasio A260/A280.
Hal tersebut memberikan hasil bahwa dengan cara menghilangkan penggunaan nitrogen cair yang relatif sulit didapatkan, di samping juga harganya yang cukup mahal, tanpa penyimpanan sampel jaringan yang akan diisolasi serta dengan memodifikasi teknik yang digunakan dapat memberikan hasil DNA yang sangat murni dan pola pita yang sangat jelas ketika dilakukan proses PCR. Hal ini memberikan efek yang sangat signifikan pada pembiayaan dan efektivitas waktu, sehingga proses analisis molekuler bisa lebih hemat dan cepat.

Simpulan
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan dapat digunakan dengan baik untuk proses PCR terlihat dari pola pita DNA yang dihasilkan sangat jelas dan tebal. Dengan demikian, teknik ekstraksi ini cukup menghemat waktu dan biaya yang dapat ditekan seefektif dan seefisien mungkin. Kemudian teknik ekstraksi DNA berbasis CTAB dengan memodifikasi serta penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, tanpa penggunaan nitrogen cair ataupun penyimpanan lebih lama (over night) ekstrak daun yang telah digerus sebelum dilakukan purifikasi seperti yang sering dilakukan untuk tanaman tahunan, dapat dilakukan pada sampel daun kemiri sunan dengan memberikan hasil yang sangat memuaskan.

Daftar Pustaka
Alves MJ Coelo .2001.Mithocondrial DNA Variation in the highly endangered cypinid fish   anaecypris hispanica : Inportance for conversation. Nature. COM NEWS@ NATURE. COM NATUREJOBS ATURREVENTS ABOUT NPG H.
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole.
Bartfai R Egedi .2003. Genetic Analysis of Two Common Carp Broodcast by RAPD and Microsattelite Markes. Aquaculture. 219 (2003) (halaman : 157 -167).
Brodgen . 2000. Pathogenesis and Infections Deseases. Washington DC . (halaman : 286).
Campbell N.A. 2002. Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation.
Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Bogor : IPB Press.
SURZYCKI, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.
Susanti Sri . 2003. Pengertian DNA dan Karateristiknya : Kamus Biologi . Jakarta : PT Gramedia Utama.
Syafaruddin. 2010. OPTIMASI TEKNIK ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA YANG EFISIEN DAN EFEKTIF PADA KEMIRI SUNAN (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). [terhubungberkala].http://perkebunan.litbang.deptan.go.id/upload.files/File/publikasi/jurnal/Jurnal%20Littri%2017(1)2011/Jurnal%20Littri%2017(1)2011-Syafaruddin.pdf [14 Desember 2011. 19:05]




Tidak ada komentar:

Poskan Komentar