Rabu, 04 Januari 2012

Jurnal Ekstraksi DNA, Teknik PCR, dan Elektroforesis

SYAFARUDDIN dan TRI JOKO SANTOSO : Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco)
11
OPTIMASI TEKNIK ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA YANG EFISIEN DAN
EFEKTIF PADA KEMIRI SUNAN (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw)
SYAFARUDDIN1) dan TRI JOKO SANTOSO2)
1)Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri
Jl. Raya Pakuwon Km2 Parungkuda-Sukabumi 43357
Telp. +62-266-7070941 Fax: +62-266-6542087
E-mail: den_ovan@yahoo.com
2)Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu, Bogor 16111
Telp.+62-251-8316897 Fax: +62-251-8338820
E-mail: trijsant@yahoo.com
ABSTRAK
Kemiri sunan merupakan salah satu tanaman penghasil biodiesel
dengan potensi yang sangat besar disamping pemanfaatannya sebagai
tanaman konservasi. Minyak kemiri sunan mengandung racun sehingga
tidak dapat dikonsumsi. Dikatakan bahwa asam α-eleostearat dengan
kandungan 50% dalam minyak merupakan senyawa yang mengakibatkan
minyak kemiri sunan beracun. Sebagai tanaman yang potensial, maka
sangat diperlukan informasi lengkap tentang tanaman tersebut, termasuk
analisis DNA. Berbagai teknik dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA
tergantung dari jenis tanaman, organ tanaman, atau jaringan tanaman yang
digunakan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan teknik isolasi dan
purifikasi DNA yang efektif dan efisien, sehingga bisa mengurangi biaya
dan penghematan waktu dalam pengerjaan di laboratorium. Penelitian
dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB
Biogen), Bogor pada bulan Juli-September 2010. Materi genetik yang
digunakan adalah contoh daun muda tanaman kemiri sunan yang diambil
dari kebun koleksi plasma nutfah dan kebun Agro Widya Wisata,
Pakuwon, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri
(BALITTRI), Sukabumi. Sedangkan bahan lain adalah paket bahan kimia
yang digunakan dalam kegiatan isolasi DNA pada umumnya. Kegiatan
meliputi beberapa tahapan: ekstraksi dan purifikasi DNA, pengukuran
konsentrasi dan kemurnian DNA serta amplifikasi DNA. Hasil ekstraksi
DNA kemiri sunan dengan menggunakan kombinasi penambahan
antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercapto-ethanol, namun
tanpa penggunaan nitrogen cair, ataupun penyimpanan lebih lama (over
night) dari ekstrak daun yang telah digerus sebelum dilakukan purifikasi
seperti yang sering dilakukan untuk tanaman tahunan pada umumnya,
memperlihatkan hasil yang sangat memuaskan, dimana DNA mempunyai
kualitas dan kuantitas yang sangat baik serta pola pita amplikon DNA
terlihat sangat jelas dan tebal, sehingga bisa dikatakan bahwa teknik isolasi
DNA yang dipakai dalam kegiatan ini adalah sangat memberikan hasil
yang nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA
kemiri sunan.
Kata kunci: Reutalis trisperma, optimasi, isolasi, purifikasi, DNA
ABSTRACT
Optimation of DNA isolation and purification techniques on Reutalis
trisperma (Blanco) Airy Shaw
Reutalis trisperma is well known as a potential plant which
produces biodiesel and to be used for the conservation as well. The
reutalis oil is toxic, therefore it is inedible due to about 50% α-eleostearat
acid content in the oil. As a potential plant, its information in more detail is
needed including the DNA analysis. There are many techniques to conduct
DNA isolation depending on kind of plants, plant organ, or plant tissue
that will be analyzed. The aim of this experiment was to find the
effectiveness and efficiency techniques of DNA isolation and purification,
so they can reduce cost and time while working in the laboratory. The
experiment was conducted at Molecular Biology Laboratory of Indonesian
Center for Agricultural Biotechnology and Genetic Resources Research
and Development (BB BIOGEN), Bogor from July to September 2010.
Young leaves of reutelis used as genetic materials were taken from
germplasms collection at Pakuwon Experimental Station of Indonesian
Spice and Industrial Crops Research Institute (ISICRI), Sukabumi. While
some chemicals were used as the other material. The activities were as
follows : DNA extraction and purification, measurement of DNA
concentration, and amplification of DNA. Deletion of resistor enzymepolysacharide,
especially for perennial plant. DNA isolation can be done
by breaking down of cell wall, cell membrane, and nuclear membrane. The
results showed that conscientiousness of DNA isolation and purification
denoted an important step to obtain clean and contaminant free of DNA, so
the banding patterns were clear. In this technique did not use
polypinilpolypirolidone (PVPP) and mercapto-ethanol such as antioxidant,
liquid nitrogen, neither over night storage of leaf extraction before used for
purification which is often used for perennial plant. In addition the results
showed that band pattern of DNA was very thick and clear, therefore this
technique can be applied for DNA isolation on Reutalis trisperma.
Key words: Reutalis trisperma, optimization, isolation, purification, DNA
PENDAHULUAN
Kemiri sunan (Reutealis trisperma (Blanco) Airy
Shaw) merupakan salah satu tanaman penghasil biodiesel
dengan potensi yang sangat besar disamping pemanfaatannya
sebagai tanaman konservasi. Habitus tanaman, berupa
pohon berukuran sedang dengan mahkota daun yang
rindang dan lebar serta sistem perakaran yang dalam, sangat
cocok untuk rehabilitasi lahan kritis marginal menjadi lahan
yang produktif berkesinambungan. Tanaman ini berasal
dari Filipina. Beberapa puluh tahun yang silam kemiri
sunan ditanam secara besar-besaran dalam area perkebunan
di daerah Karawaci dan Cilongok (Tangerang) sebagai
tanaman penghasil minyak.
Minyak kemiri sunan mengandung racun sehingga
tidak dapat dikonsumsi. VOSSEN dan UMALI (2002),
menyatakan bahwa asam α-eleostearat dengan kandungan
50% dalam minyak merupakan senyawa yang mengakibatkan
minyak kemiri sunan beracun. Minyak kemiri sunan
Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 - 17
ISSN 0853-8212
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 1, MARET 2011 : 11 - 17
12
dapat digolongkan jenis minyak nabati yang mudah
mengering. Minyak nabati adalah minyak yang mudah
mengering dan termasuk jenis minyak dengan banyak
ikatan rangkap, seperti minyak kacang kedelai, minyak
kemiri, minyak biji karet, dan lain-lain. Minyak kemiri
sunan dapat dimanfaatkan untuk berbagai keperluan seperti
sebagai insektisida alami yang sangat efektif untuk
membunuh hama dan bahan pelapis cat kapal.
Tanaman kemiri sunan sangat berpotensi untuk
dikembangkan sebagai tanaman penghasil bahan bakar
nabati (BBN) yang dapat menjawab masalah konsumsi
energi masa depan, karena penggunaan BBN lebih ramah
lingkungan dan diperkirakan akan semakin ekonomis
dengan semakin langkanya bahan bakar minyak (BBM).
Pada gilirannya BBN akan memiliki prospek yang semakin
baik untuk dikembangkan apalagi BBN merupakan sumber
energi terbarukan yang didukung pengembangannya oleh
pemerintah melalui regulasi dan kebijakan, pembiayaan
serta penelitian dan pengembangan (SAMBODO, 2008).
Tanaman ini dapat ditemukan pada ketinggian
hingga 1.000 m di atas muka laut, berbentuk pohon dengan
kanopi yang lebar dan perakarannya dalam sehingga sangat
baik sebagai tanaman konservasi. Tanaman ini dapat
menghasilkan minyak nabati yang berpotensi sebagai bahan
bio-diesel. Eksplorasi potensi genetik dari kemiri sunan ini
akan sangat mendukung program pemuliaan dan
pemanfaatannya di masa mendatang. Terlebih dengan
perkembangan ilmu bioteknologi melalui teknik-teknik
molekuler, maka usaha eksplorasi genetik akan lebih
mudah dilakukan dan akan memperoleh hasil yang lebih
akurat.
Variasi teknik molekuler sangat beragam tergantung
cara pelaksanaan untuk mendapatkan data maupun
tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan
pelaksanaan, kapabilitas sumber daya manusia, fasilitas dan
peralatan, serta kecukupan finansial (KARP et al., 1997).
Faktor dana atau biaya ini menjadi faktor penentu, karena
penggunaan bahan kimia dan atau nitrogen cair yang
harganya relatif mahal dan pengadaan bahannya yang
terkadang memerlukan waktu yang sangat lama, sehingga
menjadi penghambat dalam kegiatan di laboratorium.
Untuk itu perlu dilakukan terobosan-terobosan penelitian
yang dapat mengatasi permasalahan tersebut, khususnya
untuk tanaman tahunan atau tanaman yang mengandung
phenol tinggi, dengan cara memodifikasi metode-metode
yang sudah ada, baik dalam hal pemakaian bahan kimia
maupun pengaturan annealing temperatur pada saat running
Polymerase Chain Reaction (PCR) pada tingkat yang paling
optimal.
DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam
suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus
dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan
sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
(CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam
ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung
polisakarida dan senyawa polifenol (JOSE dan USHA, 2000).
Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu
perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(SURZYCKI, 2000).
Dewasa ini perkembangan ilmu pengetahuan sangat
pesat, diantaranya adalah perkembangan ilmu biologi
molekuler yang memungkinkan diperolehnya suatu marka
gen yang mengendalikan karakter target perbaikan dalam
program pemuliaan tanaman. Penemuan teknik dalam
memperoleh gen yang mengendalikan suatu karakter
sebagai penanda atau marker molekuler, sangat membantu
efektifitas maupun efisiensi dari pelaksanaan proses seleksi
yang akan dilakukan. Marka molekuler berdasarkan polimorfisme
yang terdeteksi pada tingkat makro molekul di
dalam sel (GUPTA et al., 2002).
Seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan
yang mampu mendukung akselerasi kemajuan dari seleksi
untuk mendapatkan karakter yang diinginkan, berbagai
metode seleksi juga berkembang, antara lain adalah seleksi
dilakukan pada tingkat gametofit dan sporofit (OTTAVIANO
dan SARI-GORLA, 1993), seleksi secara in vitro (WENZEL dan
FOROUGHI-WEBR, 1993), dan seleksi tingkat molekuler
(ARUS dan MORINO-GONZALES, 1993). Metode PCR dengan
menggunakan sepasang primer, yang meliputi : STSs
(Sequence-Tagged Sites) dan (SCARs) Sequence
Characterized Amplified Regions, DALP (Direct Amplification
of Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence
Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism),
ESTs (Expressed Sequence Tags), RAMP (Random
Amplified Microsatellite Polymorphism) dan REMAP
(Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism),
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan
modifikasinya, SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism) dan melacak beberapa sifat QTL (Quantitative
Trait Locus) (HERRAN et al., 2000; LEBRUN et al.,
2001).
Pemilihan jenis marka molekuler yang akan
digunakan dalam seleksi harus benar-benar dipertimbangkan
kesesuaiannya dengan fasilitas dan materi yang dimiliki
untuk melakukan seleksi. Penyiapan atau purifikasi gen
target juga sangat menentukan keberhasilan dari seleksi
yang dilakukan. Dari berbagai jenis marka molekuler yang
sudah ada, umumnya yang dipilih untuk dijadikan marka
molekuler guna mendukung program seleksi antara lain
adalah PCR berdasarkan marka, RFLP, RAPD, AFLP, SSR,
dan QTL (HERRAN et al., 2000; TEULAT et al., 2000;
LEBRUN et al., 2001).
Dalam bidang pemuliaan misalnya, penanda
molekuler yang sering digunakan dalam kegiatan analisis
keragaman genetik adalah RAPD (MAWIKERE, 2006;
HANNUM et al., 2003; MAFTUCHAH, 2001). RAPD adalah
penanda berbasis PCR dengan menggunakan 10 basa
primer acak. Teknik RAPD tidak memerlukan pelacak
DNA atau informasi mengenai sekuens DNA yang dilacak.
Prosedurnya sederhana dan mudah dalam hal preparasi,
dapat dilakukan secara maksimal untuk sampel dalam
SYAFARUDDIN dan TRI JOKO SANTOSO : Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco)
13
jumlah banyak, jumlah DNA yang diperlukan relatif sedikit,
dan pengerjaannya tidak menggunakan senyawa radioaktif
(KARP et al., 1996). Pada tanaman tahunan RAPD dapat
digunakan untuk meningkatkan efisiensi seleksi awal.
Teknik RAPD memberikan hasil yang lebih cepat dibandingkan
dengan teknik molekuler lainnya.
Sebelum melangkah pada kegiatan penelitian
pencarian marka genetik dengan berbagai teknik seperti
yang disebutkan pada alinea di atas, terlebih dahulu harus
ditentukan teknik isolasi dan purifikasi DNA dari setiap
tanaman yang akan diuji. Seringkali ditemukan hambatan
dalam ekstraksi DNA, khususnya untuk tanaman tahunan,
seperti kebanyakan pada tanaman koleksi yang
dimandatkan pada Balai Penelitian Tanaman Rempah dan
Aneka Tanaman Industri (BALITTRI). Pada umumnya,
teknik isolasi DNA pada tanaman tahunan memerlukan
berbagai modifikasi dari teknik standar umumnya, seperti
penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan
mercaptoethanol, ataupun penggunaan nitrogen cair untuk
membantu menghancurkan jaringan serta penyimpanan
lebih lama (over night) dari ekstrak daun yang telah digerus
sebelum dilakukan purifikasi, sehingga berdampak pada
biaya dan waktu.
Pada tulisan ini akan diuraikan teknik isolasi dan
purifikasi DNA yang efektif dan efisien (dari berbagai
teknik yang pernah dicoba), tetapi dapat menghasilkan
kualitas DNA yang bagus dan tidak terkontaminasi,
sehingga hasil dari PCR akan menunjukkan pola pita yang
jelas. Hal ini merupakan tahap awal yang sangat
menentukan dalam kegiatan penelitian biologi molekuler,
baik yang menggunakan metode sederhana maupun yang
paling canggih sekalipun. Teknik isolasi DNA adalah faktor
penentu keberhasilan tahap selanjutnya. Biasanya, teknik
isolasi DNA untuk tanaman tahunan memerlukan perlakuan
khusus seperti penggunaan nitrogen cair untuk membantu
menghancurkan jaringan, penyimpanan sampel daun di
ruang gelap atau ditutup kertas aluminium foil selama
beberapa jam sampai satu malam (over night).
Percobaan ini mempunyai tujuan untuk mendapatkan
teknik isolasi DNA berkualitas tinggi dari daun kemiri
sunan dengan menggunakan kombinasi antioksidan
polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, namun
tanpa penggunaan nitrogen cair sewaktu penggerusan
ataupun penyimpanan lebih lama (over night) terhadap
ekstrak daun yang telah digerus sebelum dilakukan
purifikasi seperti yang sering dilakukan untuk tanaman
tahunan, sehingga dapat menghemat biaya dan waktu.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi
Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB
Biogen), Bogor pada bulan Juli-September 2010. Materi
genetik yang digunakan adalah contoh daun muda tanaman
kemiri sunan yang diambil dari kebun koleksi plasma
nutfah dan kebun Agro Widya Wisata, Pakuwon, Balai
Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri
(BALITTRI), Sukabumi. Sedangkan bahan lain adalah
paket bahan kimia yang digunakan dalam kegiatan isolasi
DNA pada umumnya. Alat yang digunakan adalah
timbangan analitik, mesin PCR, perangkat elektroforesis,
gel documentation, waterbath, sentrifus, microwave oven,
lemari es dan freezer, vortex mixer, alat gelas, mortar dan
pestel, spatula, gunting, pipet ukur, pipet mikro, tip mikro,
pH meter, tabung mikrosentrifus, dan sarung tangan karet.
Kegiatan meliputi beberapa tahapan:
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Protokol yang digunakan untuk ekstraksi DNA
adalah prosedur ekstraksi yang dikembangkan oleh DOYLE
dan DOYLE (1987) berbasis CTAB dengan modifikasi
penambahan 2% Polivinilpolipirolidon (PVPP). Sampel
daun muda segar (Gambar 1) dari Kemiri Sunan ditimbang
sebanyak 0,5 - 0,7 g, lalu diletakkan dalam cawan porselein
steril dan ditambahkan 400 ul buffer ekstraksi CTAB
kemudian digerus dengan mortar steril sampai daun lumat.
Daun sampel yang telah lumat dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf 2 ml, kemudian ditambahkan kembali
buffer ekstraksi CTAB sebanyak 400 μl dan divortex
selama 2-3 menit.
Tahapan selanjutnya dilakukan inkubasi sampel
dalam water bath bersuhu 65°C selama 15 menit sambil
tabung dibolak-balik setiap 5 menit. Tahapan ini dilakukan
untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan
ke dalam sampel. Sampel kemudian divortex selama 2-
3 menit, selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 25°C.
Tujuannya untuk memisahkan debris dan komponen sel lain
yang menjadi penyebab kontaminasi dengan DNA.
Gambar 1. Daun muda yang digunakan untuk sampel
Figure 1. Young leaf used for DNA extraction sample
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 1, MARET 2011 : 11 - 17
14
Supernatan yang telah diperoleh kemudian diambil
dan ditambahkan dengan larutan Chloroform: Isolamylalkohol
atau Chisam dengan perbandingan 24:1. Penambahan
chisam ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari
kontaminan. Chloroform merupakan pelarut organik yang
dapat melarutkan protein, lipid, dan molekul lain seperti
polisakarida, sehingga diharapkan akan diperoleh supernatan
berisi DNA yang bebas kontaminan. Suspensi
kemudian divortex sampai rata untuk optimalisasi homogenasi.
Selanjutnya suspensi disentrifugasi pada kecepatan
12.000 rpm pada suhu 25°C selama 10 menit, sehingga
diperoleh suspensi dengan tiga lapisan; lapisan atas
berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh,
dan lapisan bawah berupa pelet yang berwarna hijau tua.
Supernatan pada lapisan paling atas diambil dan ditambahkan
dengan 2/3 x volume larutan isopropanol dingin
untuk presipitasi DNA. Supernatan yang telah ditambahkan
isopropanol kemudian digoyang perlahan-lahan dengan
cara membolak-balikkan tabung. Untuk mengendapkan
DNA (pelet DNA), larutan disentrifugasi kembali pada
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C selama 20 menit.
Endapan DNA dicuci dua kali dengan 70% etanol
sebanyak 500 ul, disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4°C, kemudian cairan
etanol dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan, lalu
dilarutkan dalam 50 μL bufer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 7,5) dan ditambahkan 1 μL RNAse A (10 mg/
mL) kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit
sampai 1 jam. DNA disimpan dalam refrigerator sampai
siap digunakan.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek
kuantitas dan kualitas untuk melihat konsentrasi dan
kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan
elektroforesis gel. Pengukuran konsentrasi DNA dengan
spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260
nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280.
Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui perbandingan
A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang
biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280
adalah 1,8-2,0 (SAMBROOK et al., 1989).
DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan
sehingga mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk
digunakan dalam analisis PCR. Selanjutnya dilakukan
pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk
mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA
dan keutuhan DNA hasil isolasi.
Amplifikasi DNA
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan
Mesin PCR (MJ Research tipe PCT-100), dengan kondisi
PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94°C,
dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit pada suhu
94°C (denaturasi), 1 menit pada suhu 37°C (annealing), 2
menit pada suhu 72°C (ekstensi). Seluruh produk amplifikasi
DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit
pada suhu 72°C. Analisis PCR dilakukan dengan total
reaksi 20 l mengandung 10 ng DNA genomik cetakan,
masing-masing dNTP 0,1 M (dATP, dCTP, dGTP, dan
dTTP), masing-masing primer RAPD 0,25 pmol, enzim
Taq DNA polymerase 0,04 unit dalam larutan buffer 1X
(20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1
mM DTT, 50% glycerol, 0,5%, Tween 20, 0,5% nonidet
P40 dan MgCl2 1,5mM). Hasil amplifikasi divisualisasikan
menggunakan elektroforesis horizontal dengan gel agarose
1,5% (w/v) dalam buffer 1x TAE. Gel agarose kemudian
direndam di larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di
bawah sinar ultraviolet. Hasil elektroforesis difoto
menggunakan BIO-RAD Gel Doc™ EQ.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan untuk
mengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman, organ
tanaman atau jaringan tanaman yang digunakan. Tetapi
pada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ekstraksi dan
purifikasi DNA secara optimal : 1) Penghomogenan
jaringan tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan buffer
pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan
3) Penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya
untuk tanaman tahunan.
Tanaman kemiri sunan merupakan tanaman tahunan
yang mengandung senyawa metabolit sekunder yang cukup
tinggi, seperti getah dan polifenol, sehingga perlu dilakukan
optimasi dalam mengisolasi DNAnya untuk memperoleh
DNA dengan kualitas yang tinggi. DNA tanaman dengan
kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasi
fragmen DNA tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi
pada metode ekstraksi yang sudah baku pada tanaman
tertentu perlu dilakukan.
Pada teknik ekstraksi kemiri sunan digunakan fenolkloroform
yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein.
Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena
molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik seperti
fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA
dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai
penghilang fenol-kloroform. Apabila fenol-kloroform
SYAFARUDDIN dan TRI JOKO SANTOSO : Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco)
15
masih berada di dalam sampel maka ada kemungkinan akan
menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain
yang digunakan untuk analisis molekuler.
Proses penggerusan atau homogenasi daun muda
sampel tidak menggunakan nitrogen cair, tetapi cukup
ditambahkan 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB yang
mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan
membran fosfolipid bilayer. Hal ini sesuai dengan hasil
beberapa peneliti terdahulu, diantaranya SURZYCKI (2000);
SANTOSO (2005), mengatakan bahwa bufer CTAB dengan
kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan
polisakarida dari dinding sel. ARDIANA (2009), menyatakan
bahwa penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogen
cair untuk mengisolasi DNA pada tanaman jeruk dan
pepaya dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas
yang ditunjukkan oleh pita DNA genom.
Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas dengan
spektrofotometer menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh
dari sampel-sampel kemiri sunan memiliki kualitas dan
kuantitas DNA yang cukup baik (Tabel 1). Kuantitas DNA
yang diperoleh mempunyai kisaran antara 668,80 -
5.031,39 ng/ul. Jumlah DNA ini relatif cukup banyak dan
dapat digunakan untuk analisis PCR sampai ratusan kali.
Sementara itu, kualitas DNA yang diperoleh juga berada
pada kisaran angka dimana DNA dikatakan murni yaitu
antara 1,8-1,9. Seperti dijelaskan dalam SAMBROOK et al.
(1989) bahwa DNA dikatakan murni apabila mempunyai
angka A260/A280 dalam kisaran 1,8-2,0.
Hasil pengecekan kualitas DNA dengan menggunakan
gel elektroforesis 1% juga menunjukkan hasil yang
cukup memuaskan dimana DNA yang diperoleh terlihat
utuh (Gambar 2). DNA yang utuh ditandai dengan tidak
adanya smear DNA yang dielektroforesis. Hal ini menjadi
penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh
akan lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali
terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder
seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid, sehingga
diperlukan cara untuk menghindari hal di atas. Teknik yang
digunakan dalam percobaan kali ini adalah kombinasi
penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan
mercaptoethanol pada buffer ekstraksinya. Dengan kombinasi
ini dihasilkan kualitas DNA yang baik. PVP dan
Tabel 1. Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas DNA kemiri sunan
menggunakan spektrofotometer
Table 1. Checking result of DNA quantity and quality of Reutalis
trisperma by using spectrophotometer
Sampel
Sample
Konsentrasi (ng/μl)
Concentration (ng/μl)
Kemurnian
(A260/A280)
Purity (A260/A280)
Sampel 1 3.863,31 1,80
Sampel 2 4.546,55 1,81
Sampel 3 2.823,42 1,86
Sampel 4 2.562,01 1,79
Sampel 5 5.031,39 1,80
Sampel 6 668,80 1,92
1 2 3 4 5 6
Gambar 2. Hasil pengecekan kualitas DNA sampel kemiri sunan
dengan gel elektroforesis 1%
Figure 2. Checking result of DNA quality of Reutalis trisperma with
electrophorsis gel 1%
mercatoethanol akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik
yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA. Penggerusan
secara langsung sampel segar tanpa penyimpanan
selama semalam dan tanpa penggunaan nitrogen cair (yang
diketahui sangat membantu untuk menghancurkan jaringan
dan melindungi DNA dari degradasi oleh enzim DNase)
tetapi hasil yang diperoleh sangat memuaskan yang ditandai
dengan kualitas DNA yang utuh dan murni dilihat dari nilai
rasio A260/A280 (Tabel 1 dan Gambar 2).
Untuk membuktikan bahwa DNA yang telah
diperoleh mempunyai kualitas yang sangat baik maka DNA
tersebut digunakan sebagai cetakan (template) untuk
analisis PCR dengan menggunakan program RAPD. Hasil
amplifikasi PCR menggunakan primer RAPD OPB-17
menunjukkan bahwa DNA yang diamplifikasi menghasilkan
pita DNA (amplikon) yang sangat bagus dimana pola
pita DNA terlihat sangat jelas dan tebal (Gambar 3). Dari
hasil ini dapat dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang
dipakai dalam kegiatan ini adalah sangat memberikan hasil
yang nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam
ekstraksi DNA kemiri sunan. Beberapa penelitian tentang
optimasi isolasi DNA dan protokol untuk PCR-RAPD juga
telah dilakukan untuk tanaman aromatik dan obat-obatan
serta tanaman endemik (PADMALATHA dan PRASAD, 2006;
TRIDJATMIKO, 2006; SAHASRABUDHE dan DEODHAR, 2010).
Keberhasilan di atas, telah memberikan hasil bahwa
dengan cara menghilangkan penggunaan nitrogen cair yang
relatif sulit didapatkan, di samping juga harganya yang
cukup mahal, tanpa penyimpanan sampel jaringan yang
akan diisolasi serta dengan memodifikasi teknik yang
digunakan dapat memberikan hasil DNA yang sangat murni
dan pola pita yang sangat jelas ketika dilakukan proses PCR.
Hal ini memberikan efek yang sangat signifikan pada
pembiayaan dan efektivitas waktu, sehingga proses analisis
molekuler bisa lebih hemat dan cepat.
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 1, MARET 2011 : 11 - 17
16
Gambar 3. Contoh pola pita hasil amplifikasi PCR menggunakan cetakan
DNA kemiri sunan hasil ekstraksi dengan teknik miniprep
CTAB
Figure 3. Band pattern of PCR amplification obtained by using DNA
template of Reutalis trisperma with miniprep CTAB technique
Dalam percobaan ini, pengerjaan ekstraksi dan
isolasi DNA lebih difokuskan pada bagaimana memodifikasi
bahan kimia dan teknik yang digunakan, misalnya
pada saat penggerusan, pemvortekan sampel, dan pengaturan
temperatur annealing yang digunakan pada saat
denaturasi. Menurut SUBANDIYAH (2006), kegagalan dalam
PCR sering disebabkan karena proses denaturasi yang tidak
sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95°C selama
30 detik atau 97°C selama 15 detik. Sedangkan ARDIANA
(2009) menyatakan bahwa untuk DNA yang mengandung
G+C tinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi
diperpanjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak
terlalu tinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang
umumnya mempunyai waktu paruh 40 menit pada 95°C.
KESIMPULAN DAN SARAN
Teknik ekstraksi DNA berbasis CTAB dengan
memodifikasi serta penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon
(PVPP) dan mercaptoethanol, tanpa
penggunaan nitrogen cair ataupun penyimpanan lebih lama
(over night) ekstrak daun yang telah digerus sebelum
dilakukan purifikasi seperti yang sering dilakukan untuk
tanaman tahunan, dapat dilakukan pada sampel daun kemiri
sunan dengan memberikan hasil yang sangat memuaskan.
Kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan dapat
digunakan dengan baik untuk proses PCR terlihat dari pola
pita DNA yang dihasilkan sangat jelas dan tebal. Dengan
demikian, teknik ekstraksi ini cukup menghemat waktu dan
biaya yang dapat ditekan seefektif dan seefisien mungkin.
Selanjutnya untuk isolasi DNA tanaman tahunan lain yang
mempunyai kemiripan dengan kemiri sunan atau yang
mempunyai kandungan phenol tinggi, disarankan untuk
mengikuti protokol seperti yang dilakukan pada kemiri
sunan.
DAFTAR PUSTAKA
ARDIANA, D.W. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman
pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi
bufer CTAB. Bul. Teknik Pertanian. 14(1): 12-16.
ARUS, P. and J. MORENO-GONZALES. 1993. Marker-assisted
selection. In: Hayward, M.D., N.O. Bosemark, and I.
Romagosa (Eds.) Plant Breeding: Principles and
Prospects. Chapman & Hall. London. p.314 - 331.
DOYLE, J.J. and J.L. DOYLE. 1987. A rapid DNA isolation
procedure for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem. Bull. 19:11-15.
GUPTA, P.K., R.K. VARSHNEY, and M. PRASAD.
2002. Molecular Markers: Principles and Methodology.
In: Jain, S.M., D.S. Brar, and B.S.
Ahloowalia (Eds.). Molecular Techniques in Crop
Improvement. p.9-54.
HANNUM, S., A. HARTANA, dan SUHARSONO. 2003.
Kemiripan genetik empat populasi kelapa genjah
berdasarkan random amplified polymorphic DNA.
Hayati 10(4): 125-129.
HERRAN, A., L. ESTIOKO, D. BECKER, and M.J.B. RODRIQUEZ.
2000. Linkage mapping and QTL analysis in
coconut. Theor. Appl. Genet. 101:292 - 300.
JOSE, J. and R. USHA. 2000. Extraction of geminiviral DNA
from a highly mucilaginous plant (Abelmoschus
esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349 - 355.
KARP, A., O. SEBERG, and M. BUIATTI. 1996. Molecular
techniques in the assessment of botanical diversity.
Ann. Bot. 78: 143 - 149.
KARP, A., S. KRESOVICH, K.V. BHAT, W.G. AYAD, and T.
HODGKIN. 1997. Molecular tool in plant genetic
resources conservation: A guide to the technologies.
IPGRI Technical Bulletin. No. 2.
LEBRUN, P., L. BAUDOUIN, R. BOURDEIX, J.L. KONAN, J.H.A.
BARKER, C. ALDAM, A. HERRÀN, and E. RITTER. 2001.
Construction of a linkage map of the rennel island
tall coconut type (Cocos nucifera L.) and QTL
analysis for yield characters. Genome. 44:962-970.
MAFTUCHAH. 2001. Strategi pemanfaatan penanda molekuler
dalam perkembangan bidang hortikultura.
Makalah Sarasehan Pemanfaatan Penanda Molekuler
di Bidang Hortikultura. Perhorti Jatim -
Deptan.
MAWIKERE, N.L. 2006. Plasma nutfah kelapa Papua dan
hubungan kekerabatannya dengan populasi kelapa
Indonesia lainnya dan Papua New Guinea
berdasarkan penanda RAPD. Disertasi Doktor
Sekolah Pascasarjana, IPB. Bogor.
OTTAVIANO, E. and M. SARI-GORLA. 1993. Gametophytic and
Sporophytic Selection. In: Hayward, M.D., N.O.
Bosemark, and I. Romagosa (Eds.) Plant Breeding:
Principles and Prospects. Chapman & Hall. London.
p.332-352.
SYAFARUDDIN dan TRI JOKO SANTOSO : Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco)
17
PADMALATHA, K. and M.N.V. PRASAD. 2006. Optimization of
DNA isolation and PCR protocol for RAPD
analysis of selected medicinal and aromatic plants
of conservation concern from Peninsular India. Afr.
J. Biotechnol. 5:230-234.
SAHASRABUDHE, A. and M. DEODHAR. 2010. Standardization
of DNA extraction and optimization of RAPD-PCR
condition in Garcinia indica. International Journal
of Botany. 6(3): 293-298.
SAMBODO, M.T. 2008. Energy sector in Indonesia and
environmental impact: from fossil fuel to biofuel.
Jurnal Ekonomi dan Pembangunan, XVI(1): 1-9.
SAMBROOK, J. and D.W. RUSSEL. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. New York: Cold-Spring
Harbor Laboratory Press. 2nd edition 165p.
SANTOSO, P.J. 2005. Modified CTAB-based DNA isolation
procedure for fruit crops. Jurnal Stigma XIV(1):1-4.
SUBANDIYAH, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk
Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan.
Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.
Malang. p.43-50.
SURZYCKI, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.
TEULAT, B., C. ALDAM, R. TREHIN, P. LEBRUN, J.H.A. BARKER,
G.M. ARNOLD, A. KARP, L. BOUDOUIN, and F. ROGNON.
2000. An analysis of genetic diversity in coconut
(Cocos nucifera) population from across the
geographic range using sequence-tagged microsatellite
(SSRs) and RFLPs. Theor. Appl. Genet.
100:764-771
TRIDJATMIKO, K.R. 2006. Penggunaan Metode PCR untuk
Deteksi Cepat Keragaman DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.
Malang. p.22-25.
VOSSEN, H.A.M. dan B.E. UMALI. 2002. Plant Resources of
South-East Asia No 14. Prosea Foundation. Bogor.
Indonesia.
WENZEL, G. and B. FOROUGHI-WEBR. 1993. In vitro
Selection. In: Hayward, M.D., N.O. Bosemark, and
I. Romagosa (Eds.) Plant Breeding: Principles and
Prospects. Chapman & Hall. London. p.353 - 370.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar