Rabu, 04 Januari 2012

Laporan Praktikum Mikrobiologi : Perhitungan Mikroba Secara Tidak Langsung

Pendahuluan
Mikrobiologi adalah suatu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang mikroorganisme dan interaksi mereka dengan organisme lain dan lingkungannya. (Singleton.2006)
Sejarah tentang mikroba dimulai dengan ditemukannya mikroskop oleh Leeuwenhoek (1633-1723). Mikroskop temuan tersebut masih sangat sederhana,
dilengkapi satu lensa dengan jarak fokus yang sangat pendek, tetapi dapat menghasilkan bayangan jelas yang perbesarannya antara 50-300 kali. (Skou, dan Sogaard Jensen. 2007)
Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan hidup. Jasad tersebut dapat hidup hamper di semua tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relative panas, dari ligkungan yang asam hingga basa. Berdasarkan peranannya, mikroba dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu mikroba menguntungkan dan mikroba merugikan (Afriyanto 2005).
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung, perhitungan tidak langsung dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006).
Perhitungan langsung (direct count) untuk jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dan sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme diperkirakan  dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006).

Tujuan
Praktikum bertujuan menghitung jumlah mikroorgaisme pada air selokan, air cucian sayur, air rendaman tahu, air cucian telenan, dan air sungai secara tidak langsung.

Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah tabung reaksi bertutup, erlenmeyer, bulp merah, pipet mohr 1 ml, spirtus, spreader, dan cawan petri.
Bahan-bahan yang digunakan ialah alcohol 70%, air selokan, air cucian sayur, air rendaman tahu, air cucian telenan, air sungai, larutan fisiologis, aquades, plastic, dan alcohol.

Prosedur
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum. Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja  steril serta kering. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Sample yaitu air selokan, air cucian sayur, air rendaman tahu, air cucian telenan, dan air sungai masing-masing dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup berisi 9 ml larutan fisiologis. Kemudian larutan fisiologis tersebut diencerkan kembali dengan memipet 1 ml dengan pipet mohr yang steril dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup yang beisi larutan fisiologis pula dengan faktor pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, dan 10-7, lalu mengocoknya perlahan.
Larutan fisiologis 10-5, 10-6, dan 10-7 yang telah dicampurkan sample masing-masing dipipet 1 ml dan dipindahkan ke dalam cawan petri berisi media PCA (Plate Count Agar). Kemudian disebarkan secara merata dengan menggunakan spreader. Spreader sudah harus disterilisasi dengan cara dibakar oleh spirtus sebelumnya. Tutup kembali cawan petri, lalu di kocok dengan pola angka delapan. Setelah selesai, seluruh cawan petri diberi pelabelan dan dimasukkan ke dalam plastic, lalu diinkubasi selama 2x4 jam.

Data dan Hasil Pengamatan

Nama Sample
Faktor Pengenceran
Gambar
Jumlah bakteri
Air rendaman tahu
10-5
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air rendaman tahu
10-6
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air rendaman tahu
10-7
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air selokan
10-5
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air selokan
10-6
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air selokan
10-7
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air sungai
10-5
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air sungai
10-6
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air sungai
10-7
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air cucian sayur
10-5
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air cucian sayur
10-6
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air cucian sayur
10-7
87
Air cucian talenan
10-5
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air cucian talenan
10-6
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)
Air cucian talenan
10-7
Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD)

Perhitungan
sel     =    ∑koloni x   1      x  1 ml 
                                    Fp           0,1
           
=    87 koloni   x   1      x  1 ml 
                                        10-7         0,1
            =    8,7x109 CFU/ml

Pembahasan
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat. Sample yang digunakan pada percobaan ialah air selokan, air cucian sayur, air rendaman tahu, air sungai, dan air cucian talenan. Kelima macam jenis air tersebut berfungsi agar mendapatkan perbandingan yang diketahui untuk bakteri atau mikroorgaisme yang ada didalamnya. Kemudian tabung reaksi bertutup berisi larutan fisiologis disediakan delapan buah untuk larutan fisiologis, kemudian larutan fisiologis 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, dan 10-7. Pengenceran tersebut bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang lebih sedikit sehingga dapat diketahui berapa sel bakteri yang terdapat di dalam sample. Pengencer yang digunakan dalam percobaan ialah larutan fisiologis (larfis), namaun ada larutan lain yang juga berfungsi sama yaitu PBS (Phospat Buffer Salin), dan aquades steril. Pengenceran tersebut tentu juga dilakukan proses sterilisasi yaitu dengan memipet cairan sample 1 ml dan pengenceran selanjutnya dengan memipet 1 ml dari pekat ke rendah, menggunakan pipet mohr yang telah steril. Pipet mohr dsterilkan terlebih dahulu karena diinginkan tidak ada bakteri lain terutama dari pipet mohr yang mengganggu hasil sel bakteri yang sebenarnya. Kemudian teknik aseptik juga dilakukan saat perlakuan masing-masing sample dilakukan dekat apai karena api berfungsi sebagai pengsteril daerah kerja dan mulut tabung reaksi setelah dan sebelum dimasukkan sample, didekatkan ke arah api agar mikroorganisme yang tidak diinginkan terbunuh.
Setelah pengenceran selesai, maka dilanjutkan dengan perlakuan teknik cawan sebar. 1 ml masing-masing pengencer 10-5, 10-6, dan 10-7, dipindahkan ke dalam cawan petri berisi agar PCA. Teknik penyebaran dilakukan oleh spreader secara merata. Spreader sebelumnya juga mendapat perlakuan aseptic agar spreader tersebut steril dan tidak ada mikroorganisme lain yang ada pada spreader tersebut dan pengerjaan dilakukan di dekat api. Stelah semua perlakuan selesai, cawan petri dimasukkan ke dalam plastic lalu diinkubasi selama 2x24 jam. Proses inkubasi berfungsi agar mikroorganisme bereproduksi atau tumbuh dalam media tersebut selama waktu 2x24 jam atau 2 hari.
Cara yang paling umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri adalah perhitungan jumlah bakteri hidup. Dengan metode tersebut, pengenceran berseri dari sampel yang mengandung mikroorganisme ditanam pada media pertumbuhan yang sesuai. Suspensi dapat disebarkan pada permukaan pelat agar (spread plate method) atau dicampur dengan agar cair, yang kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Pelat agar tersebut kemudian diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme bereproduksi dan membentuk koloni yang terlibat tanpa bantuan mikroskop. Diasumsikan bahwa setiap koloni bakteri akan muncul dari 1 sel bakteri. Oleh karena itu, dengan menghitung jumlah koloni dan memperhitungkan faktor pengenceran, jumlah bakteri pada sample asal dapat ditentukan (Harmita 2006).
Perhitungan bakteri secara tidak langsung dibagi menjadi dua metode yaitu metode agar tuang (pour plate method) dan metode sebar di atas pelat agar (spread plate method). Metode agar tuang, seperti halnya metode perhitungan jumlah mikroorganisme hidup lainnya, dilakukan dengan mencampurkan sample pada media padat yang mendukung pertumbuhanmikroorganisme, dan kemudian menginkubasi pelat sehingga setiap sel bakteri dapat membelah dan membentuk koloni. Dengan demikian, jumlah koloni yang tumbuh tersebut dapat dihitung. Karena pada umumnya, tidak mempunyai gambaran tentang jumlah bakteri dalam saple, penyiapan pengenceran berseri hampir selalu dibutuhkan untuk memastikan bahwa kita akan mendapatkan pengenceran dengan jumlah bakteri yang dapat dihitung. Sedangkan metode sebar di atas pelat agar adalah teknik dengan menyebarkan sample (yang telah diencerkan) di atas permukaan pelat agar dalam cawan petri. Umumnya antara 0,1 ml dan 1 ml sample disebarkan di permukaan media padat dengan menggunakan tangkai gelas steril atau spreader. Cawan kemudian diinkubasi dan jumlah koloni yang tumbuh dihitung (Harmita 2006).
Pengamatan setelah 2x24 jam, menghasilkan data hanya air cucian sayur dengan faktor pengenceran 10-7 yang menghasilkan 87 koloni bakteri, sedangkan semuanya hanya menghasilkan TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). Hasil yag ditetapkan untuk bisa dihitung adalah koloni yang berjumlah 30-300 koloni. Apabila terdapat kurang dari 30 koloni, maka TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung). Lalu terdapat lebih dari 300 koloni, maka TBUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung). Perkiraan sementara ialah yang paling banayk bakterinya ialah fktor pengenceran 10-5 karena pengenceran tersebut masih tergolong pekat sehingga bakteri yang tumbuh pun banayak. Perkiraan tersebut terbukti dengan munculnya sample air cucian sayur yang memiliki faktor pengenceran lebih tidak pekat yaitu  10-7 menghasilkan 87 koloni bakteri. Seluruhnya menghaasilkan data TBUD (>300 koloni) karena waktu inkubasi terlalu lama yaitu 2x24 jam, sehingga bakteri tumbuh subur dan terlalu banyak tumbuh pada waktu tersebut. Idealnya, waktu yang dibutuhkan untuk inkubasi hanayalah 1x24 jam, sehingga bakteri yang tumbuh masih dapat dihitung.
Cara perhitunga bakteri ialah menggunakan rumus yaitu
sel     =    ∑koloni x   1      x  1 ml 
                                    Fp           0,1
           

=    87 koloni   x   1      x  1 ml   
                           10-7       0,1             
 =   8,7x109 CFU/ml
CFU/ml ialah satuan yang digunakan dalam jumlah sel. CFU/ml adalah Coloni Forming Unit per ml. Semakin besar pengenceran, maka jumlah koloni semakin kecil sehingga mikroorganisme dapat dihitung. 8,7x109 CFU/ml merupakan sel bakteri berjumlah banyak yang terdapat dalam air cucian sayur pada faktor pengenceran 10-7, sedangkan hasil dari sample lainnya sudah lebih banyak dibandingkan dengan jumlah sel tersebut sehingga TBUD. Faktor pengenceran yang paling baik ialah 10-7 karena dapat menghasilkan jumlah koloni yang lebih sedikit, sehingga lebih dapat dihitung.
Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh mikroorganisme baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya (Lay 1994).
Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifannya sehingga hasil perhitungan kadang kala menjadi bias. Kondisi pertumbuha bakteri, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan Ph, sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada. Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Contoh yang alami, misalnya pada tanah yang mengadung berbagai jenis microorganisme, tidak mungkin untuk menghitung semua mikroorganisme yang terkandung didalamnya dengan cara viable plating tersebut. Kekurangan tersebut dapat menjadi suatu keunggulan jika kita ingin menghitung populasi mikroorganisme spesifik. Sebagai contoh, kita dapat mendesain prosedur yang selektif untuk menghitung bakteri koliform atau kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya (Harmita 2006).





Simpulan
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulakan bahwa praktikan dapat mengetahui dan membandingkan jumlah sel yang terdapat pada sample. Hail yang didapatkan ialah 8,7x109 CFU/ml untuk sample air cucian sayur dengan faktor pengenceran 10-7. Sedangkan sample lainnya telah tumbuh terlalu banyak bakteri sehingga TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung).

Daftar Pustaka
Afriyanto Eddy. 2005. Pakan Ikan dan Perkembangannya. Jakarta : Penerbit Kanisius (halaman : 140)
Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC (halaman : 125-129)
Lay B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo Persada (halaman : 126)
Singleton Paul.2006. Dictionary of Microbiology And Molecular Biology Third Edition. England : John wiley & Sons Inc. (halaman : 475)
Skou Torben dan Sogaard Jensen Gunnar. 2007. Microbiologi. Englang : Forfattern Og Systime. (halaman : 8)

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar